临床试验招募抗肿瘤新药的主要药效学与毒理学研究ppt* 安全性药理学试验 新作用机制的细胞毒类抗肿瘤药应进行安全性药理学试验（ICH） * 试验设计关注点： 一般应测定啮齿类和非啮齿类动物的MTD或啮齿类动物的STD10 应采用临床拟用给药途径 尽量采用临床拟用剂型 试验恢复期一般应为2~4周 FDA：至少一种动物应进行一般行为、摄食量血液学、血液生化学和组织病理学检查 建议测定最大耐受剂量下的AUC 急性毒性试验 * 推算临床起始剂量（按体表面积计算）： EMEA: 以最敏感动物的MTD的1/10为I期临床研究的起始剂量 FDA: （1）若啮齿类动物STD10的1/10不引起非啮齿类动物产生毒性，以啮齿类动物STD10的1/10作为I期临床研究的起始剂量；（2）若引起毒性，以不引起非啮齿类动物出现严重、不可逆毒性的剂量的1/6作为I期临床研究的起始剂量 有文献（1986年）：1/10LD10为I期临床研究的起始剂量 急性毒性试验 * 叶酸抑制剂不宜使用啮齿类动物 铂类化合物有时不宜使用犬 急性毒性试验 相关动物： * 采用啮齿类和非啮齿类动物 给药频率尽量与临床一致 给药期限为4周（1～2个治疗周期）的长期毒性研究可支持药物进行I期和等周期的II期临床试验 给药期限一般最长不超过6个月 恢复期多为6~8周 长期毒性试验 * 遗传毒性、生殖毒性和致癌性试验 一般不需要在临床研究前完成遗传毒性试验 一般不需要进行致癌性试验 不一定要求上市前提供生殖毒性试验资料 * 细胞毒抗肿瘤药非临床研究技术要求的相关文献 美国 （1）The current toxicology protocol of the National Cancer Institute (Lowe MC., et al, Fundamentals of Cancer Chemotherapy, McGraw-Hill, 1984) （2）Regulatory Considerations for Preclinical developmental of anticancer drugs (DeGeorge JJ., et al, Cancer Chemother Pharmacol, 1998) 欧盟 Note for guidance on the preclinical evaluation of anticancer medicinal products CPMP/SWP/997/96 (effective: Jan 99) 中国 细胞毒类抗肿瘤药药效学和毒理学研究技术指导原则 卫生部/1993.7 日本 正制定指导原则草案，现有“关于支持抗癌药临床试验和上市注册的毒性试验的问题和解答”/厚生劳动省/2004.8 * 技术要求比较（1） 毒理研究内容 美国 欧盟 日本 一般药理 急性毒性 Rodent Non Rodent 长期毒性（较短给药期）a Rodent Non Rodent 长期毒性 - Rodent (6-monthb) Non Rodent (6-monthb) Non Rodent (9-month) ICH-Phase I （新机制） Phase I Phase I Phase I/II Phase I/II Phase III/注册 Phase III/注册 不要求 ICH-Phase I （新机制） Phase I Phase I Phase Ia Phase Ia Phase II/III/注册 Phase II/III/注册 不要求 ICH-Phase I （新机制） Phase I Phase I 同ICH 同ICH 同ICH - 可小于9个月 a 2 weeks to 1 month or 1 to 2 cycles b maximum of 6 months or 6 to 8 cycles * 技术要求比较（2） 毒理研究内容 美国 欧盟 日本 遗传毒性 － 致癌性 － 生殖毒性 Seg I Seg II Seg III 注册 不要求 不要求 Phase III/注册 不要求 Phase III/注册 不要求 不要求 推 荐 不要求 Phase II 不要求 Phase I ？ Phase I ？ Phase III ？ * 小 结 由于恶性肿瘤危及生命和细胞毒抗肿瘤药性质，其非临床评价具有鲜明的特点 其非临床研究可在较大程度上预测临床不良反应及其可逆性 非临床安全性研究对确定安全、有效的临床起始剂量（通过MTD 或STD10)和临床试验方案有重要的作用 应从利弊权衡角度来把握与其研究和评价的灵活性 * 从肿瘤患者利益（快、挽救生命）出发，结合临床研究阶段， 权衡其有效性（ ）和安全性（ ）（利和弊）， 决策非临床研究内容、阶段性，判断是否可进入各期临床研究 利弊权衡-有效性和安全性 * 评价标准 裸鼠移植瘤模型 推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的效应。 肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。 * 评价标准 肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V = 1/2×a×b2 或π/6×a×b×c 其中a、b、c分别表示长宽高。两公式的相关性极好，可采用任一公式。 根据测量结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV）， RTV = Vt / V0。 其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。 * 评价标准 抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%） TRTV T/C % = ────×100% CRTV TRTV：治疗组RTV ；CRTV：阴性对照组RTV。 疗效评价标准：T/C %

　　0.05为有效。 * 评价标准（小鼠肿瘤模型） 生长较慢小鼠肿瘤采用与裸鼠移植瘤同样的测量瘤径的评价方法。 生长较快小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。试验结束后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小于400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。 * 评价标准（小鼠肿瘤模型） 疗效评价公式： 给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重 肿瘤生长抑制率 = ───────────────── ×100% 阴性对照组平均瘤重 评价标准 肿瘤生长抑制率

　　90%-95%，候选化合物组细胞分化，成熟粒细胞占比例越高，说明该化合物的分化效果越好 * 分化诱导剂 实体瘤细胞的分化诱导 常用细胞株、试验方法及评价标准 ： 人肝癌HepG2、SMMC7721 主要测定细胞的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白含量，γ-谷氨酸转移酶(γ-GT)、酪氨酸转氨酶 ( TAT ) 活性及观察细胞形态。 分化细胞AFP含量、TAT和γ-GT活性明显降低，白蛋白含量增加，细胞胞质增加、核缩小。 * 分化诱导剂 体内试验 常用人癌细胞小鼠肾囊膜下移植试验、小鼠髓单核细胞白血病试验和人癌细胞裸小鼠移植瘤模型等。 可选两种模型，根据肿瘤鼠生存时间、肿瘤的体积及形态变化，观察分化诱导效果。 重复试验一次 * 肿瘤治疗增敏剂 增敏剂主要是指放射治疗增敏剂，能增加临床上恶性肿瘤放射治疗或其它治疗的疗效及降低治疗后的复发率。 药效学试验分为体外和体内试验： * 肿瘤治疗增敏剂 体外试验 分别选择对放射、化疗药物具有中、低度敏感的人肿瘤细胞株， 采用MTT、SRB或细胞集落形成方法进行化合物的细胞毒性试验，以IC50值作为评价指标。 * 肿瘤治疗增敏剂 体内试验 选用对射线及化疗药物敏感性较小的三种实体瘤模型进行试验，其中至少有一种人癌裸鼠移植瘤模型。 由强致癌物或病毒等因素诱发的肿瘤，或者不是在同一品系动物身上移植传代的肿瘤往往会出现免疫反应，因此都不能用于肿瘤治疗增敏剂研究。 疗效评价可参照体内抗肿瘤试验 * 抗肿瘤药物的安全性评价 * 非临床安全性评价的目的 药物筛选和临床研究间的过渡 预测药物在人体中的安全性 预测药物的毒性靶器官和可逆性 判断药物是否可进入临床研究 为 I 期临床研究的起始剂量和临床研究方案提供参考 * 细胞毒类抗肿瘤药毒性特点 骨髓抑制：5-FU，Taxol 肝脏毒性: 甲氨喋呤，6-巯基嘌呤 胃肠道毒性： 5-FU，长春新碱 肾毒性：顺铂，甲氨喋呤 心脏毒性：白消安，阿霉素 呼吸系统毒性：甲氨喋呤，环膦酰胺 神经毒性：5-FU，Taxol 举例： * 安全性评价的主要内容 安全性药理学试验 急性毒性试验 长期给药毒性试验 遗传毒性试验 生殖毒性试验 致癌性试验 * 抗肿瘤新药的主要 药效学与毒理学研究 * 新药的开发过程 $600 millions 6 to 12 Years Drug Discovery Non-Clinical Development Clinical Trials Phase III Phase II Phase I Market Launch CS FHD PD Submission am Toxicology/ADME * 抗肿瘤药物分类 (1)细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等 (2) 生物反应调节剂(biological response modifier) (3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent) (4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer) (5) 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor) (6) 分化诱导剂(differentiation inducing agent) (7)生长因子抑制剂(growth factor inhibitor) (8)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) * 抗肿瘤药物药效学 包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。 * 体外抗肿瘤活性试验 试验目的 对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 * 试验方法 选用10-15株人癌细胞株 根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养 推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。 试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。 * 测定细胞生长和存活方法 MTT法和XTT法是代谢测定法，没有颜色的tetrazolium salt (MTT 和XTT)被细胞还原，产生具有颜色的与活细胞数成比例的formazan， 比色测定。 为了简化MTT solubilization步骤，发展了XTT tetrazolium测定方法，MTT还原产生不溶性formazan ,比色测定前溶解于DMSO，XTT试剂可被活细胞直接代谢成水溶性formazan，不需进一步处理培养细胞，便可以立即读取光密度。方便简单，其缺点是可产生相对比较高的背景数据，同时也具有MTT的不稳定终点特性。 * 测定细胞生长和存活方法 对系列蛋白质染色剂进行实验，发现磺酰罗丹明B （sulforhodamine B）(SRB)可替代tetrazolium assay方法， 具有最好的燃料结合强度，信噪比率，并且和细胞数具有很好的线形关系，SRB是一亮粉色染料，在稀醋酸中，可结合于TCA固定细胞的碱性氨基酸上。具有十分稳定的终点 。 * 评价标准 以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线 采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。 体外试验至少重复一次。 * 体内抗肿瘤试验 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型 动物肿瘤移植模型 人类肿瘤裸鼠移植瘤模型 重复试验 鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型、肿瘤新药原位接种模型和中空纤维测定(hollow-fiber assay)等 方法。 * 动物 动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证。 雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同。 小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克。 评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠。 * 肿瘤模型 小鼠肿瘤模型 淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。 * 肿瘤模型 人类肿瘤裸鼠移植模型 应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人类肿瘤裸鼠移植试验。 * 缺点 部分模型很难构建， 皮下抑制肿瘤很少转移，生存时间不适合作为试验终点 优点 可预测细胞毒类化合物的活性 有助于筛选化合物，为临床用药程序和联合用药方案提供参考 可用于研究获得性药物抗性 人癌移植模型 * 人癌移植模型 NCI回顾性研究： 多个人癌移植模型试验的阳性结果可在一定程度上提示临床有效性 非小细胞肺癌移植模型具有临床相关性 通常移植临床拟治疗的肿瘤细胞 * 人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。 移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于 15-20代 * 人类肿瘤裸鼠移植模型建立时的注意点 细胞要求达到最低质量保证标准（支原体、MAP、人类同功酶、核型和体内致瘤性的检查）、适应同一培养液以及具有可重复的生长和药物敏感特性。制备大量的保种细胞，并冷冻保存，用于药物筛选过程中细胞经20代传代后的替换。所有细胞在筛选过程中均要进行详细特性确认，如组织病理、超微结构、免疫细胞化学，以确定和证明组织和肿瘤类型。 * 肿瘤模型产生免疫原性的表现 近交系动物的遗传特性发生漂移，对肿瘤模型产生免疫性。 产生免疫性的表现有： 1.在传代和对照组中出现肿瘤消退，假如肿瘤出现溃疡、消退和再生长，可能是感染造成，如果是溃疡、消退，并且不再生长，通常是由于免疫原性引起。如果用60mg的同种肿瘤攻击动物，结果没有生长，基本可以肯定产生了免疫性。 * 肿瘤模型产生免疫原性的表现 2.在化疗实验中有大于2个剂量水平的治愈时，应怀疑有免疫原性在起作用。 3.在生命延长期实验中，存活动物的生命延长增长百分率应小于250%，如果大于250%应怀疑有免疫原性在起作用。 4.缺乏明显的侵袭性和转移，可能是由于肿瘤的恶性程度比较低，也可能是由于免疫性问题造成。 * 肿瘤模型产生免疫原性的表现 5.对药物反应性的改变表明免疫原性的形成。 6.肿瘤在后期阶段比早期阶段的反应更好，肯定表明是免疫性参与，对于均质性的肿瘤模型而言，开始给药的时间越早，肿瘤反应越好，免疫反应要经对抗原的识别和处理后才能产生。 给予小鼠两次用X-射线天后，给处理和没有处理的小鼠移植活的肿瘤细胞，检测免疫性的产生是一种很好方法，费时、费力。 * 试验过程 肿瘤接种方法 皮下接种 腹腔接种 原位接种 * 皮下肿瘤模型 选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5 mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为（1-5）×106。 * 腹水瘤模型 无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为（1-5）×106。 * 原位接种模型 原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法 * 实验设计 试验设阴性对照组、阳性对照组、治疗组。 治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100—300mm3后将动物随机分组。 动物数普通小鼠每组10只，裸鼠6只。 * 剂量设置 治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置，高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量。 阴性对照组给予相应的溶剂； 阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物， 如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。 * 阳性对照药选择原则 疗效确切 与被试物质化学结构类似 与被试物质有类似的作用机理。 * 药物配制 溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5N HCl)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节pH在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射。 * 给药方案和给药途径 分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。 给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。 可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。患者招募 腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。 * 评价标准 腹水瘤模型 接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数。如阴性对照组20%动物存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。

　　GB T 32610-2016_日常防护型口罩技术规范_高清版_可检索.pdf